腫瘤生物和基因治療概述

導讀：腫瘤生物和基因治療概述

一、前言
腫瘤的生物治療主要是通過調動宿主的天然防衛機製或給予機體某些物質來取得抗腫瘤的效應。隨著現代生物技術的發展，生物治療日趨重要，已經逐漸成為治療腫瘤的第四手段了(1)。它的日益增加的臨床應用是基於兩方面的發展；其一是對抗腫瘤防衛機制的基礎理論的深入理解，其二是生物技術的迅速發展使得臨床上大規模運用生物反應調節劑成為可能。腫瘤的基因治療，目前經FDA批准臨床試驗的大多數都是通過調動和調節機體免疫功能來實現的，因此也是生物治療的重要組成部分。生物治療和基因治療雖然仍是處於發展的嬰儿期，但已有很多典型的病例及其反映出來的理論探索的成功性足以激發人們將這一療法繼續向前推進。面向二十一世紀的腫瘤治療，抗癌藥物的發展將從細胞毒性藥物的攻擊轉向非細胞毒性藥物的調節。其中生物治療和基因治療將起到極其重要的作用。
二、生物反應調節劑的概念
生物反應調節劑(BiologicalReoeModifiers,RMs)的概念涉及範圍較廣。既包括一大類天然產生的生物物質又包括能改變體內宿主和腫瘤平衡狀態的方法和手段（2）。雖然作用機制多種多樣，但不外乎二大方面。通過乾擾細胞生長、轉化或轉移的直接抗瘤作用或通過激活免疫系統的效應細胞及其所分泌的因子來達到對腫瘤進行殺傷或抑制的目的。
（一）、定義
Mitchell曾對BRMs有過很具體的定義（3）。一種物質只要具備以下條件之一的就可稱為BRMs；1.直接增強宿主抗腫瘤的反應。經免疫刺激來增加效應細胞的數量或活性，或增加可溶性中介物的生產，如淋巴因子或單核因子等。 2.通過減少抑制性機製而間接增強了宿主對腫瘤的免疫反應。 3.增強宿主對細胞毒物質造成損傷的耐受能力，如通過增加骨髓的白細胞前體來提高化療病人的耐受力。 4.改變腫瘤細胞細胞膜的特點以增強它們的免疫原性，改變轉移方式或使瘤細胞對免疫殺傷機製或細胞毒藥物更敏感。 5.預防或逆轉細胞轉化，或促進不成熟腫瘤細胞的成熟。 Mihich的定義就更加廣泛了：一種物質或方法(Aroaches)，能通過調整宿主對腫瘤的反應使二者之間的相互作用朝向有利於治療腫瘤的方向發展，均可叫BRMs。根據這個定義，除某些藥物、細胞因子外，凡是藉助於生物學技術的一些新的方法和手段如某些基因治療等均可列入這個範疇。事實上，這也是當前發展最快、最富有挑戰性的一個領域。
（二）、生物反應調節劑的種類
根據BRMs的定義，從目前的研究資料來看，BRMs有下列種類：
天然或基因重組細胞因子：包括白細胞介素(Interleukin)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)等。
抗腫瘤的各類體細胞和輔助性的造血幹細胞：如LAK細胞、TIL細胞、TAK細胞；骨髓幹細胞、外周血和臍帶血幹細胞等。
抗體：包括各類抗腫瘤單克隆抗體、抗細胞表面標記抗體等。
基因治療。
腫瘤疫苗。
抗血管生成類。
細胞分化誘導劑。
酶製劑及酶抑製劑。
某些菌類及其有效成份：如卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(CP)、鏈球菌(OK432)、濟南假單胞菌等。
植物藥包括中藥的有效成份：如香菇多醣、雲芝多醣、黃芪多醣、刺五加多醣、扶正女貞素LL-E、枸杞多醣、淫羊霍多醣、商陸多醣、人參花總皂苷、冬蟲夏草等。
有機酸及小分子合成劑：如左旋咪唑(Levamisole)。
其他。
各類BRMs在抗腫瘤作用中雖然機制有所不同，但不是孤立行動的。它們相互間有一定的關係和影響，形成了BRMs的作用網絡。它們與免疫系統、內分泌系統、神經系統等相互影響與協調，共同維持生命機制的穩定與平衡。這就是生命機制的穩態論(Homeostasis)。美國學者Oldham在1984年提出了生物調節(BRM)理論後，十幾年來這一領域發展極快。
三、各類生物治療的概況
生物治療的領域涉及面極廣，幾乎生物反應調節劑的所有方面都有不同程度的進展。本文僅就細胞因子；過繼性細胞免疫治療；腫瘤疫苗；單克隆抗體和基因治療等方面的進展和問題做一代表性的介紹。
（一）、細胞因子
自從基因工程技術在生物醫學領域中大規模發展使用後，細胞因子是應用最廣泛、療效最明確的一類BRMs。現以乾擾素(IFN)、白介素(Interleukin)、集落刺激因子(CSF)等為例來簡要說明它們的臨床使用情況。
1、干擾素(IFN)：IFN是一種糖蛋白，首先是由Isaacs和Lindenma在1957年作為一種病毒感染的細胞產物來描述的，它可以防止病毒的進一步感染。 IFN的主要作用有：直接抗病毒作用；增強主要組織相溶性抗原(MHC)和腫瘤相關抗原(TAA)的表達；增強自然殺傷細胞(NK)的細胞毒作用；增強抗體依賴性細胞的細胞毒(ADCC)作用；直接的抗細胞增殖作用和抗血管生成作用等。 IFN有三種，即IFN-a、IFN-和IFN-g。 IFN-a和IFN-具有相同的受體即Ⅰ型受體，IFN-g聯接在Ⅱ型受體上。
IFN-a是第一個用於臨床的重組基因細胞因子，可皮下或肌肉給藥，血漿半衰期為4-6小時，生物活性持續2-3天。於1981年開始臨床試用，1986年被FDA正式批准。主要有效病種見表1。
表1、IFN-a的劑量和有效病種
腫瘤方案和劑量有效率%範圍(均值)
血液腫瘤
毛細胞白血病3MU/天70-90（80）
慢粒白血病5MU/米2/天45-85（58）
淋巴細胞性淋
巴瘤(低度)3-50MU/米2/天或每週三次27-85（48）
多發性骨髓瘤5-12MU/米2/天或每週三次3-18（15）
實體瘤
惡性黑色素瘤5-20MU/米2/天或每週三次7-19（18）
腎癌5-20MU/米2/天或每週三次8-23（15）
Kaposi?s肉瘤3-50MU/米2/天或每週三次3-67（30）
內分泌性胰腺
腫瘤3-5MU/米2/天或每週三次33-77（50）
類癌12-24MU/米2/天或每週三次20-40（20）
部分摘自：HaeRM,ordeEC.Oncology6:19-26,1992
　　
2、白介素(Interleukin)：白介素這一名稱是特指由白細胞產生的可以調節其他細胞反應的任何可溶性蛋白或糖蛋白物質。在強調這些多肽物質在免疫系統所起的協調作用的這一名稱時，它與生長因子(GrowthFactors)這一稱呼的區別是人為造成和誤導的。因為大多數白介素就是生長因子，反之也一樣。做為免疫反應的激素，白介素是通過內分泌(Endocrine)、自分泌(Autocrine)和旁分泌(Paracrine)等的相互作用來實現的。這種白介素鏈索反應的發生首先是由病原性接觸和特異性抗原性反應在局部開始的，由於分泌的白介素有所不同，各類效應細胞表面所分佈介素受體種類和數量的不同而引發了各自不同功能的表達。這些細胞包括造血細胞、免疫細胞、內皮細胞和某些非免疫系統的細胞。而白介素的旁分泌作用包括了引發、放大、維持和終結不同階段的免疫反應等。此外，白介素也通過對血管內皮細胞、成纖維細胞、角化細胞、脂細胞等的作用發揮全身調節作用。目前，以白介素為命名的細胞因子已達15種。其中，以白介素-Ⅱ(IL-2)研究得最為深入，應用最為廣泛。
IL-2是一種133氨基酸的糖蛋白，分子量15-kd，含一鏈內二硫鍵。通過T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞表面的受體而起作用。由於它能支持T細胞的生長，最初在1976年被定名為T細胞生長因子。 IL-2和IFN-g代表了Th1輔助細胞產生的主要的細胞因子。是由抗原和IL-12所誘導的，可被IL-4和IL-10反相調節。 IL-2在T細胞的生長成熟中起了關鍵性的作用。它的多種生物學功能主要包括誘導抗原刺激的T細胞增殖，增強MHC限制性抗原特異性T細胞的細胞毒作用；誘導大顆粒淋巴細胞、NK細胞的MHC非限制性LAK活性；對其他細胞因子的誘導作用。
1985年12月美國國家腫瘤研究所(NCI)的StepheRoseerg在《新英格蘭醫學雜誌》上首次報導了25名晚期黑色素瘤和腎癌病人經大劑量IL-2加LAK細胞治療後，有效率達44%。這一成績轟動了世界並開創了IL-2及其所誘導細胞治療腫瘤的臨床應用。經過十幾年的臨床實踐和全世界各大研究所和醫院的努力，對於IL-2治療腫瘤的評價日趨客觀和冷靜。
美國FDA、加拿大和歐洲的有關醫療衛生權威機構批准用於臨床的IL-2商品名為Aldesleukin和Proleukin。 FDA批准IL-2用於轉移性腎癌的基礎資料是從七個機構參加的多中心性研究的255名病人中獲得的。所用方案由NCI外科部提供，具體為：IL-26-7.2x105IU/公斤體重/8小時，15分鐘內靜脈注射，第1至5天，第15至19天。總有效率14%，包括CR4%（4）。有效部位包括肝、腎上腺、腎床、腎原發部位、肺和淋巴結等轉移處。總有效率雖然不高，但中位有效時間長達20個月，大部分CR者長期存活。說明了這一療法可以給一部分晚期病人帶來一定好處。
IL-2對黑色素瘤的治療也處於與腎癌相似的狀態。在美國的三個臨床Ⅱ期研究表明，用NCI外科部高劑量方案在134名病人中僅獲總有效率20%的結果。其中，5名CR佔4%，22名PR佔16%(5)。由於有效率不高，有效持續時間較短，聯合其他BRMs和化療藥物的化學免疫學治療(Chemo-immunotherapy)或生物化學治療(Bio-chemotherapy)正在積極開展中。在黑色素瘤所進行的大量臨床研究結果表明，有效率穩定在45-60%。是該病種目前有效率最高的治療手段。
3、造血生長因子(HematopoieticGrowthFactors)：造血生長因子是一類細胞因子的總稱。即它們都可以影響造血細胞，在主細胞的生長和分化上起重要的調節作用，在成熟造血細胞的功能激活上也起重要作用。迄今已有25種以上的細胞因子被證明對造血活性有影響。現將常用的幾種根據它們作用於不同的造血細胞譜系(Lineages)大致分類如下，見表2。目前美國FDA批准正式臨床使用的只有三種，即粒細胞生長因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞生長因子(GM-CSF)和促紅細胞生成素(EPO)。

表2、部分造血細胞因子總結
細胞因子克隆年代染色體部位美國使用情況適應症
刺激白細胞生
長的細胞因子
G-CSF198617q11-22市場銷售(1)預防化療所致骨髓抑制的感染
(2)自體骨髓移植的恢復
(3)治療嚴重中性粒細胞減少症
(4)動員外周血祖細胞
GM-CSF19855q23-31市場銷售同上
IL-3/GM-CSF融
合分子(PIXY321)1989 臨床Ⅲ期中同上
M-CF19855q23臨床Ⅲ期中免疫增強（抗真菌）
刺激紅細胞生
長的細胞因子
EPO19857q11-22市場銷售治療癌症或愛滋病的貧血
刺激血小板生
長的細胞因子
TPO19943q26-27臨床Ⅰ/Ⅱ期中緩和化療引起的血小板減少症
IL-319865q23-32臨床Ⅲ期中同上
IL-619867q15臨床Ⅲ期中同上
IL-11199024臨床Ⅱ期中同上
IL-119842q14臨床Ⅱ期中同上
影響原始造血細胞活性的細胞因子
SCF19904q臨床Ⅲ期中動員外周血祖細胞
flt3配體1993 臨床前尚未確定

（二）、過繼性細胞免疫治療
80年代初期以來，對LAK細胞的特徵進行了廣泛的研究。這是一群不同於NK或CTL的溶細胞性群體。它們細胞表面標記特徵為非MHC限制性殺傷細胞。可以是CD3+或CD3-的非粘附性的並帶有NK樣標記如CD+16和CD56+的細胞群體。新鮮腫瘤靶細胞上被LAK細胞識別的決定簇性質尚不清楚。這種決定簇廣泛表達於新鮮和培養中的腫瘤細胞上和培養的正常細胞上。但新鮮正常細胞上並不具有。 LAK細胞是外周血淋巴細胞在病人開始IL-2治療幾天后反跳性增殖時收集的。在體外與IL-2一起培養數天后發展為具高度非特異性細胞毒性細胞後再返輸給病人。
迄今，沒有令人信服的證據說明加用LAK細胞後，療效比單獨使用IL-2要好。再加上治療的費用和繁瑣性，這一療法基本已被放棄。只有在移植後淋巴細胞增殖性病(PostTralantatioLymphoproliferativeDiseases,TLD)中最近重新試用了LAK細胞並取得一定療效，但要注意不能同時輸注IL-2，以免刺激淋巴性腫瘤生長。
TILs是直接從腫瘤組織中分離出來的T淋巴細胞，經在離體培養(exvivo)中由IL-2誘導而成。具有腫瘤特異性殺傷活性，特別是對黑色素瘤有效。早期的報告與單獨使用IL-2對比具較高的有效率(34%比17%)。但可重複性和緩解時間的長期資料尚缺。此外，需要新鮮的腫瘤組織和長時間的細胞培養，與相應的費用加在一起考慮，使之能在臨床研究階段以外的實際應用成為問題。
第三類IVS(IVitroeitized)細胞的特異性是介於LAK和TILs細胞之間的，需要腫瘤細胞做為抗原來刺激。其中TAK(TumorAntigen-activatedKiller)細胞就是典型代表。外周血淋巴細胞分離出來後，經腫瘤可溶性膜抗原、抗CD3單克隆抗體和IL-2一起培養擴增後返輸給病人，達到治病的目的。中國醫學科學院腫瘤醫院生物治療協作組用該種療法曾觀察了20名晚期腎癌病人，其中CR1名，PR4名，有效率為25%。截止到96年7月平均生存13個月，一名11公分長下腔靜脈瘤栓者生存36個月，仍健在。本療法所用細胞數量是109級，遠遠低於Roseerg等所用LAK細胞的1011級，但療效在同一水平上。說明TAK比LAK有更好的特異性，因此攻擊性更強。但仍有一些問題需要解決，如抗原強度和呈遞表達的效率，共刺激信號的提供等，因此療效不穩定。本來免疫原性較強的黑色素瘤效果反而不好。因此，如何使過繼性細胞免疫治療更好地運用於臨床實踐還需深入研究。目前，其它各類新型的IVS細胞也在努力研製中。
（三）、腫瘤疫苗
受疫苗在感染性疾病治療中的影響，腫瘤疫苗在本世紀初開始使用於臨床。有所不同的是：前者一般用於預防，而後者往往是治療的目的。二種疫苗均是使用減毒的全細胞、細胞壁、特異性抗原或非致病性的活微生物來刺激病人的免疫系統。用腫瘤疫苗進行主動免疫治療的目的是：克服因腫瘤產物造成的免疫抑制狀態；刺激特異性免疫來攻擊腫瘤細胞；增強腫瘤相關抗原(TAA)的免疫原性。近年來，有關腫瘤疫苗的研究主要集中在解決以下幾方面：1.TAA在腫瘤宿主對抗中是靶目標；2.脫落TAA造成的宿主免疫抑制；3.抗原變換和免疫的異質性；4.增加疫苗免疫原性的策略。其中，比較有啟發的範例有：紐約KaplaCancerCenter用神經節苷脂類黑色素瘤疫苗後觀察到可刺激CD8+T細胞對黑色素瘤相關抗原MAGE-3和MART-1/Melan-A作出相應反應，而且是HLA-A2(ClaⅠHLA)限制性的。 15名HLA-A2+黑色素瘤病人術後上述反應陽性者隨訪12-21個月時仍無復發，而陰性者3-5個月內復發。最近，MSKCC做成了第一個純化的抗原，目前正在臨床使用中。
當前，腫瘤疫苗治療的研究狀況應該說是處於又一重要階段。雖然過去25年在腫瘤特異性主動免疫治療上做了大量的努力，但尚無任何一種腫瘤具有疫苗治療的標準方案。從許多臨床Ⅰ、Ⅱ期研究的報告中看到這一療法確實在一部分病人上獲得PR、CR，而且基本無毒性反應。值得注意的是有些病例持續時間相當長可達數年之久。因此腫瘤疫苗的臨床使用價值不再是個問題。疫苗的研究也再次成為熱點，有些已進入臨床Ⅲ期研究。希望在不久的將來，能看到某些腫瘤疫苗的標準治療方案問世。
（四）、單克隆抗體
自從Kohler和Milstei1975年首次描述了單抗後，發展了大量的抗人TAA的單抗。它們的作用在腫瘤的鑑別診斷和診斷上已確定其地位，但在腫瘤的治療上剛剛處於起步階段。
1.診斷上的用途：
單抗用於診斷目的是發展較快的，產品也趨於多樣化。現舉例說明如下：（1）.放射免疫造影(RadioImmuneImaging)，1993年FDA批准了銦111放射標記的鼠單抗CyT103(OncocintOV/CR)，這是抗表達在產粘蛋白腺癌細胞上TAG72糖蛋白的。可用於對結腸癌和卵巢腫瘤的體外影像檢查。臨床研究證明在原發和復發性結腸癌中CyT103具92%的高度敏感性，但特異性略低，為67%。約1/3病人因使用CyT103而改變臨床處理方式。雖診斷肝髒病灶不如CT敏感，但對腹腔盆腔內的複發灶更敏感。缺點為尚不能精確定位。 （2）.放射免疫導向手術(RadioImmuno-guidedurgery,RIGS)，術前給病人注射抗TAG72的碘125標記的單抗-B72.3，用一種敏感的手提g射線探測儀可以在術中有效地測得放射標記的腫瘤組織從而有效地進行切除。這就叫放射免疫導向手術(RIGS)。臨床Ⅱ期研究證明RIGS的敏感性為85%，使30%的病人改變了已定的手術方式。這樣就有可能使本來可以治癒的腫瘤得到更徹底的切除和在晚期病人中避免切除不必要的組織器官。目前一個前瞻性的對新一代抗TAG72單抗在原發和復發性結腸癌術中的作用的研究剛剛完成，結果正在總結中。
2.治療上的用處：
長期以來，發展抗腫瘤的單抗在臨床上一直未獲成功。 FDA曾批准的二種非抗腫瘤單抗為：(1).鼠單抗muromonab-CD3(OrthocloneOKT3)能抗T細胞，作為接受器官移植病人的免疫抑製劑來使用。 (2).Abciximad(Reoro)抗血小板上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體的嵌合性人/鼠單抗的Fab片段，在冠脈形成術或動脈粥樣切除術後的高危組病人中用於抑制凝集。單抗臨床使用考慮的主要方面為：通過補體、ADCC或誘導凋亡的直接細胞毒作用；單抗連接到藥物、毒素或放射性核苷酸上；抗基因型(特異性)的單抗來誘導特異性免疫反應；抑制生長因子或它們的受體的單抗；離體進行腫瘤淨化或激活免疫淋巴細胞等。直至1997年底，FDA批准了Rituxan用於抗腫瘤的臨床治療(7)。 Rituxan是一種抗B細胞表面標記CD20的單克隆抗體。對複發性和化療抗拒性的非霍奇金淋巴瘤有48%的有效率。主要作用機制為誘導ADCC，補體依賴性細胞毒性和凋亡。更令人欣喜的是，1998年9月FDA通過了又一個用於腫瘤治療的單抗Herceptin。它作用的靶目標是具有HER2基因過度表達的腫瘤細胞。已觀察到在三分之一弱的乳腺癌婦女中由於Herceptin的使用而增加了化療的敏感性，提高了有效率和延長了生存期。 Rituxan和Herceptin的成功問世使人們相信單克隆抗體的臨床治療不再是可望不可及的課題。
（五）、腫瘤基因治療
腫瘤的基因治療可以用一句話概括為：將核苷酸轉移到靶細胞中以擾亂或糾正某些病理生理過程或其他物質和手段可以通過糾正靶細胞中的基因或基因產物的異常而達同樣目的。
基因轉導大致可分二大類，體外和體內基因治療。體外基因治療是基因在離體(exvivo)情況下被轉移或轉導到靶細胞中後再放回到動物或人體中。體內基因治療是基因在體內直接被轉導到靶細胞中。要完成這一任務，牽扯到2個相互獨立而又有關聯的因素。即治療性的核苷酸或基因及其運載系統。基因的作用機制、大小、表達的穩定性、預期的效果等均是選擇的重要因素。第二個因素決定了能否把一個治療性的基因有效地運載到靶細胞並進行表達。運載系統也叫載體(Vector)，是一個微基因盒(Minigenecaette)。由一段能啟動靶基因或轉基因轉錄的核苷酸或叫啟動子的成份和一個聚腺苷酸化信號(Polyadenylatioignal)組成。後者能穩定轉錄了的mRNA。這個微基因盒通常位於一大段核苷酸的主鏈骨架裡。這一骨架的序列可以簡單到像在噬菌體裡的一樣，因此可使載體在體外隨細菌而增殖。也可複雜到像大DNA病毒一樣。此外，這個微基因盒通常由其他一些大分子所包繞，如蛋白和碳水化合物等。它們在轉基因的穩定性、靶向性和表達上執行某些特異性功能。
到目前為止，已鑑定的認為可能有治療價值的基因數量迅速增加。美國FDA已批准的治療腫瘤的臨床試驗項目已有103項。其中以P53在頭頸部腫瘤和非小細胞肺癌做的工作最多，已看到有PR、CR和生存期延長的病例。目前這一觀察還在繼續進行中。然而，能否真正將治療性基因成功地運用到人體的特定部位中還取決於一個有效的高度選擇性的轉運系統和高效的基因表達。 1999年9月17日賓西法尼亞大學人類基因治療研究所發生的一例死於基因治療本身的意外事故正是說明了這個問題。雖然輸注了38萬億個腺病毒顆粒企圖在肝臟得到足夠的鳥氨酸甲酰氨轉移酶(OTC)基因的表達以糾正遺傳酶缺陷病。但僅有1%轉基因達到靶細胞且未看到明顯的基因表達。而過量的病毒顆粒分佈到全身各器官激發了內在的免疫性和全身炎性反應，導致了病人的死亡。因此，目前在基因治療的基礎科學研究上更多的精力還是強調發展更好的載體。
另一方面，基因治療的進展也顯示出一些可喜的苗頭。最近在法國巴黎的第十屆國際抗癌會議上Momparler等（8）報告了六例Ⅳ期非小細胞肺癌的病人在驗證新藥Decitabine的I期臨床試驗中，有三例活過了16個月。該藥的作用機理是重新激活腫瘤抑制性基因來防止正常細胞轉化成癌細胞和誘導腫瘤細胞的再分化，使其轉回正常細胞。由於結果意外地好，未等I期做完就搶先作了報導。