癌的靶向基因治療基礎

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癌的基因治療是基因治療的一個分支,也是其中最為活躍的一個分支.本文簡介癌的靶向基因治療的一些有關基礎知識.用免疫學方法研究癌的靶向基因治療也是癌的基因治療的一個重要方面,但不在本文討論的範圍之內.本文將依次簡介下列內容:
基因治療的一般原則,細胞的靶向,基因的靶向,病因靶向,分子分類,腫瘤幹細胞,腫瘤的逆轉,瞻望-個體化治療.

一.基因治療的一般原則據美國國衛生研究院2000年的定義:基因治療指採用實驗醫學乾擾手段改變活細胞的遺傳物質與疾病作鬥爭. 用基因治療進行治療的疾病主要有人類嚴重免疫缺陷病,HIV,癌症.

治療的途徑有ex vivo和in vivo.

靶向癌基因治療採用的導入系統主要為病毒型載體.用作基因治療的病毒可分為兩型.

(一) 複製缺陷型病毒此時病毒作為載體,運送藥物前體、自殺基因、瘤基因和抑瘤基因等.

(二) 有病毒基因丟失型(onyx-015,HSV-1),增加治療基因及啟動子修飾型(CV706,腺病毒,編碼GM-CSF的重組牛痘病毒).野生型病毒(呼腸孤病毒、皰疹性口腔炎病毒).

據此運送插入基因載體的又可分為病毒載體和非病毒載體,常用的病毒載體有逆病毒、腺病毒、腺相關病毒等.非病毒載體則有脂質體、脂質體/DNA複合體(lipoplex)、裸DNA等.

onyx-015曾是一個引人注目的、靶向治療腫瘤的重組腺病毒.原設計思路是p53基因突變是人類腫瘤中最常見的遺傳學改變.腺病毒的E1B 55K可與宿主細胞中野生型p53結合併將其滅活.因此構建了將E1B除去的重組腺病毒.它不再滅活wtp53,只能在p53缺失的細胞中復制,從而可靶向p53突變的細胞,通常即為腫瘤細胞.

但後來發現onyx-015也能在wt p53細胞中復制,複製效率要低很多,複製速度也慢.由於onyx-015畢竟還能殺死瘤細胞,故仍在進行臨床試驗.

腺病毒一類DNA病毒在細胞內復制結果致細胞裂解死亡,故稱溶瘤病毒,正常細胞一般不罹患.溶瘤病毒的治療指數可很高,可達100,000:1,一般化療的治療指數為6:1,因此近年來備受關注.例如皰疹性口腔炎病毒.

呼腸孤病毒在動物試驗中業經證實對卵巢和結腸癌有效.目前進入臨床試驗的溶病毒有onyx-015,CV706,G207,V-GM-CSF,Reo,VSV.

(二) 細胞靶向

細胞特異性靶向的基礎:

真核細胞基因的典型結構包括啟動子、轉錄起始位、翻譯起始侮位、5”端非翻譯區、外顯子、翻譯經止密碼、3”端非翻譯區、內含子等.

真核細胞基因的啟動區,例如組織特異性啟動子的結構十分複雜.部分反映了真核細胞基因調控的複雜性.

轉錄是基因表達的起始階段.啟動子與增強子與基因表達的組織或細胞特異性有密切關係.

轉錄因子是與啟動子或增強子區結合的蛋白質,可激活或抑制一特定基因的轉錄.轉錄因子結構有三個結構域,即DNA結合域、反式激活域和蛋白-蛋白相互作用域.轉錄因子與啟動子中TATA box 及增強子結合以調節RNA聚合酶的作用還需輔激活因子、激活因子和抑制因子的參與.轉錄因子DNA結構域的一些基序結構也已查明.如鋅指、亮氨酸拉鍊、helix-loop-helix等等.轉錄因子與基因表達的系一般有四種類型,即組成型、可誘導型、組織或細胞特異型、發育調節型.一些組織或細胞特異型啟動子列表如下:

人們也找到一些選擇性在腫瘤組織或細胞內基因表達相對特異的啟動子,見表:

從目前情況來看利用這些天然的啟動子組裝靶向性、特異性、轉錄活性很強、能發揮治療某種腫瘤的基因不能滿足臨床要求,因而己有設想,綜合各種優點人工設計組裝或合成符合臨床要求的啟動區.

(三)基因靶向

靶向基因的基礎知識:

根據迄今對腫瘤分子生物學的研究,與腫瘤發病相關的基因主要是兩類,即瘤基因和抑瘤基因.

瘤基因能引起動物和人的腫瘤,能將培養中的正常細胞轉化成惡性細胞.由於點突變、基因擴增、或染色體重排致瘤蛋白增多,因此屬於獲得功能(gain in function).瘤蛋白刺激細胞分裂生長.瘤基因來自細胞的原瘤基因,是正常細胞中原瘤基因的突變、活化型.原瘤基因蛋白刺激正常細胞有序的增殖,瘤蛋白是細胞信息轉導因子,刺激腫瘤細胞無序繁殖.

據Volgstein B認為人結腸癌的發病符合多階段、多基因的線性模型.涉及多個瘤基因和抑瘤基因的參與.我們用CGH的資料構建腫瘤發生的樹模型,認為腫瘤發生和發展是多階段、多基因、多途徑的.

單基因病的治療,如ADA,可以針對一個缺陷基因用一個野生型基因取代獲得成功,腫瘤的治療不能採用同樣的策略.但最近根據轉基因動物身上的研究,對這一看法提出了異議.

抑瘤基因的情況則有所不同.一些眾所周知的抑瘤基因是細胞週期的重要調控者,將它們的野生型
轉入瘤細胞後對惡性表型有明顯的影響.因此靶向抑瘤基因的基因治療仍是不斷探索的熱點.

(四)病因靶向

腫瘤的病因主要是化學致癌物,但也有一部分與病毒有關.如肝癌、宮頸癌、鼻咽癌都是我國的常見癌,病因都涉及DNA瘤病毒.近年來報導的RNAi被稱為基因組的免疫系統,具有很強的抗病毒作用. RNAi的作用最早在線蟲中發現的.將雙鏈DNA注入線蟲,用原位雜交檢測mRNA(par-1),未註射及注射反義RNA均為陽性,只有陰性對照和注射dsRNA的無mRNA表達.RNAi現像有以下特點:

干擾因子為dsRNA,不是ssRNA.mRNA和蛋白質的不表達有序列特異性.對外顯子而非內含子有效.作用很強,每個細胞只要幾個分子就有效.作用且持久,可影響下一代.效果還可跨越細胞屏障(口服,浸泡).這一現象相繼在細菌、低等動物和植物中證實,但在哺乳動物細胞中遇到了困難,長鏈dsRNA啟動全局性基因沈默(非特異性,如乾擾素反應).這一問題在2001年獲得突破,發現短dsRNA(～22nt)能在哺乳動物細胞中誘導RNAi.

RNAi現象的機制十分複雜,是一種多個酶參與的反應

RNAi的生物學作用主要在調節基因功能,同時作為基因組的＂免疫系統＂,抗病毒感染、抑制轉位子活性、對異常RNA發生反應.應用方面主要也是作為檢測基因功能的工具和抗病毒和基因治療. 因此可作為癌的靶向基因治療工具.2002年10月才取得驚人的進展.宮頸癌與人乳頭瘤病毒咸染有關,乳頭瘤病毒的E6和E7蛋白分別與p53和Rb蛋白結合,將它們滅活是宮頸癌主要的發病機制.應用RNAi技術使E6和E7表達沈默就能使體外培養的宮頸癌細胞不增殖和凋亡.

(五)分子分類

腫瘤的分類對臨床治療至關重要,目前主要依據病理形態學分類,但病理組織學表現相同的腫瘤,臨床病程及對治療反應可明顯不同.

腫瘤的分類可有兩種情況,一是發現新的亞類.二是歸入早已明確的類別.分子病理學的研究表明,根據基因表達譜.可將有些腫瘤進一步細分.Golub開創了腫瘤分子分類的先例,根據基因表達譜可明確區分AML和ALL,屬於笫二種分類情況.接著Alizadeh 等對瀰漫性大B細胞淋巴瘤的研究.基因表達譜分析表明LDBCL可進一步分為GC B-like和Activated B-like 兩個亞型,屬於笫一種分類.治療後兩者的五年生存率明顯不同.因此腫瘤的分子分類引起了廣泛的關注.先後己報導了前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結腸癌等等.鼻咽癌最常見為鱗癌三級,也即低分化鱗癌.據我們用基因表達譜初步研究,NPC的低分化鱗癌至少可分為兩個亞型,它們的生物學及臨床意義正在進一步研究中.

(六)腫瘤幹細胞

腫瘤起源於乾細胞的看法早就存在,現在提出”腫瘤幹細胞”的概念,指腫瘤中含有少數細胞具有無限的增殖潛能,驅動腫瘤的形成和生長.正常乾細胞是引起細胞轉化的突變的靶,而瘤幹細胞則驅動腫瘤細胞增殖.幹細胞最重要的特徵就是自我更新(self-renewal),正常和瘤幹細胞都具備這種能力,不同的是正常乾細胞自我更新也即細胞分裂增殖和分化是受控制的,增殖和分化維持平衡,處於有序狀態;而腫瘤幹細胞的自我更新是失控的、無序的.

目前有關腫瘤幹細胞存在的證據主要也是根據它的自我更新能力,實驗驗證有體外的集落形成試驗和體內的脾集落檢定.例如小鼠骨髓瘤中只有1%～0.01%的細胞能在軟瓊酯中形成集落,同樣肺癌、卵巢癌或神經母細胞瘤在軟瓊酯中具集落形成能力的也只有0.1%～0.02%的比例.白血病細胞也只有1～4%的細胞在體內能形成脾集落.據此現在認為少數腫瘤細胞有持久的致瘤能力和形成腫瘤,它們就是腫瘤幹細胞.其他瘤細胞只有有限的自我更新能力.腫瘤幹細胞對於治療腫瘤有重大意義.現在的治療可使瘤體積縮小,主要殺死增殖能力有限的瘤細胞,瘤幹細胞未殺死就成為複發的基礎,如治療時能特異性殺死瘤幹細胞,即使瘤體積不縮小,待以時日,腫瘤也會消退.

因此靶向基因治療或靶向治療均應指向瘤幹細胞.目前尚無好的實用的辦法將瘤幹細胞與–般瘤細胞或正常乾細胞區分.這巳成為一個研究熱點.有報導人AML幹細胞是CD34＋CD38–細胞,約佔AML細胞的0.2%,為此提供了線索.

(七)腫瘤的逆轉

腫瘤的逆轉是某些癌瘤細胞失去惡性表型的過程,研究腫瘤的逆轉最終會使我們了解一個癌瘤細胞如何逆轉惡性的分子生物學基礎,所得結果將有助於人們與癌瘤作鬥爭.1997年用體細胞核移植成功克隆了Dolly羊,成為生物學發展史上的一個里程碑.這一成就對腫瘤研究有何意義?其實早已報導了用豹蛙腎腺癌細胞核移植至激活的卵母細胞可發育成游泳的蝌蚪,70年代Mintz B等曾用小鼠的畸胎瘤細胞植入囊胚期胚胎的囊腔內,分娩出嵌合體小鼠,雖然這一實驗並非嚴格意義上的核移植,但也多少說明腫瘤細胞可在特定環境下失去惡性表型,逆轉成正常表型.瘤細胞是特殊類細胞的體細胞,體細胞是定向分化的細胞,植入去核卵細胞後可重新編程,發育為個體.我們將小鼠B16-F1黑色素瘤細胞核植入去核卵細胞也能進入重新發育,目前可發育到32個細胞期.重新編程開始於植入後0～0.5小時,我們己經對兩細胞期的早期胚的基因表達譜進行了系統研究,結果正分析中.這種研究雖離實際應用尚早,但可預期,有朝一日闡明其重新編程機制,特別是分離出有效的胞質因子,就有可能投入應用.

(八)瞻望-個體化治療

人類基因組計劃於1991年啟動,計劃15年完成,2001年提前完成草圖,今年2003年定稿,宣告正式提前完成,進入後基因組時代.人類基因組計劃完成了30億bp的測定,發現人類基因組在DNA水平上就有很多變異,最常見也是最重要的是單核苷酸多態性(SNP),平均每1000個bps中就有一個.因此SNP成為第三代遺傳標誌,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關.

我們曾就7個NPC的相關基因的SNP與NPC易感性的關聯分析進行研究,發現兩個基因的SNP與NPC的易
感性有一定關聯:YH1(G1990398T) G/G OR=3.166,CI(95%)=1.784～5.619; CYP2E1(T499840C) T/T
OR=4.225,CI(95%)=1.873~9.531.

CYP2E1是P450藥物代謝酶的一種,不同基因型對多種藥物的反應不一樣.由此可見SNP的研究是未來醫學個個體化治療的基礎