導讀：國產人參種質資源研究進展
人參(PanaxgiengC.A.Meyer)是應用最廣泛、研究最深入的中藥之一。人參的種質資源是人參生產的源頭，種質的優劣對產量和質量有決定性的作用，其研究對人參的引種栽培、良種選育和資源保護有重要意義。人參的種質資源主要包括野生人參(山參wildmountaigieng)資源和各地的栽培人參(栽培參，園參gardegieng)資源。據考證我國人參栽培史已有2000多年，大規模栽培出現在清代。但只是近20～30年人參種內變異才被重視。近10年來，我國科研人員對國產栽培參的種質資源進行了系統的研究並取得很大進展，對山參的研究也積累了許多經驗。由於DNA指紋等分子生物新技術的應用使本來很困難的工作得以在短時間內完成，現將這幾方面的進展簡述如下。1 野生人參對山參的研究多限於一些基礎工作，如山參形態、分佈、生態環境、發育規律、產量形成、化學成分、組織粉末鑑別等，嚴格地說這些研究不屬於種質資源研究，真正的種質資源考察、鑑別、比較及遺傳研究資料十分匱乏。 1.1 形態特徵山參形態的報導多集中在藥材特徵即乾燥(或鮮活)根的描述。孫三省等對“蘆”、“丁”、“體”、“皮”、“紋”、“點”等6個方面的藥材特徵進行了詳細描述和分類［1］。最典型山參的根應具有細長的根莖(蘆)，棗核狀的不定根(丁)，主根縱向短粗，橫向伸展分成兩支，形似人體，外皮緊湊緻密，肩部有較重環紋，鬚根上有珍珠點等特徵。 1.2 分佈山參主要分佈在我國東北地區，朝鮮和俄羅斯也有。古時我國太行山脈、長白山脈、大小興安嶺為人參主要分佈地區。到1950年代，山參資源縮小在北緯40°～48°，東經117.6°～134°的有限範圍內。目前山參資源還在進一步萎縮，僅局限在長白山脈，少量分佈於小興安嶺南麓。由於森林面積的大幅度縮小和過分採挖，今天即使在自然保護區腹地也難見到山參，1992年已被列為國家珍稀瀕危植物［2］。 1.3 特殊生境［3］ 地形：山參分佈的大地形為各種類型的山地，平原無野生種。土壤：森林腐植土，含水量59.1%～46.2%，pH值5.2～5.4。植被：針闊混交林，樹種為柞、紫椴、糖椴、紅松等10餘種，由大喬木、小灌木、草本植物形成高、中、低3層自然屏障，鬱閒度0.8。氣候：分佈地區年平均氣溫3℃，年降水量500～1000mm。年平均濕度70%。林間小氣候特點：山參點平均光照僅有林裸光的5.6%。氣溫18.5～22.5℃，溫差5.7℃。濕度80%。 1.4 生長規律［4］ 生長緩慢，1～5年為幼苗，三小葉。 5～10年5小葉，40～50年3～4批葉。生長年限與平均根重間的回歸模型為Y=0.0513X1.6894；根重變化規律分3個階段：1～50年緩慢增長階段，年均增重0.5～0.7g；50～125年快速增長階段，年均增重1～2g；125年以後，平均增重3.3g。也有比較不同年齡山參和栽培參根重增重規律的研究［5］，但差異主要是環境而非遺傳造成的。2 栽培人參栽培人參種質資源研究方面已發表了很多論文，對人參的研究可能是所有中藥品種中最深入的，已取得的成績主要有以下幾方面。 2.1 變異類型的鑑別及產區混雜情況調查栽培參是從山參馴化來的混雜群體，經上百年生態環境的作用及生產者的選擇，逐漸分離出一些變異類型。人參種內變異的重要性直到1970年代才被認識，最早的突破是從鑑別根的變異與產量關係開始的，孫先［6］首次報導了變異類型“大馬牙”與產量的關係，提出“大馬牙”為高產類型。吳元山比較了不同變異類型(6年生)在相同管理條件下的產量，證明“大馬牙”比“圓膀圓蘆”增產153%，比“線蘆”、“竹節”類型增產442%～533%。隨後有更多的統計學分析確認了變異類型在產量上的差異性［7］。迄今共發現了十幾個變異類型，依據根的形態分為大馬牙、二馬牙(包括二馬牙圓蘆、二馬牙尖嘴子)、圓膀圓蘆(包括大圓蘆、小圓蘆)、長脖(包括草蘆、線蘆、竹節蘆)［8］；依據果實顏色有紅果、黃果、橙黃果3種；依據莖的顏色有紫莖、綠莖、青莖3種；依據果穗有緊穗、散穗2種等［9］。報導最多的是大馬牙、二馬牙、長脖、圓膀圓蘆、黃果5個變異類型，又稱農家類型landrace。研究包括它們在各產地的混合比例及與產量的關係［10］、形態［11］和組織解剖［12］、農藝性狀［5］、抗逆抗病性［13］、生理生化［14］、染色體核型［15］、種皮紋飾［16］、化學成分［17］等。結論是：大馬牙是產量最高的類型，黃果是人參總皂苷含量最高的類型，長脖(石柱參的基原植物)、圓膀圓蘆(石柱參的基原植物)和二馬牙(邊條參的基原植物)因根形好且各有特色而聞名。 2.2 人參農家類型農藝性狀的遺傳分析趙壽經等［18］用方差和聚類分析研究了集團選擇的各類型子代17個苗期性狀，單株重等12個性狀差異顯著，並認為“大馬牙”與“二馬牙”親緣關係接近，“圓蘆”與“長脖”接近。在對農家類型子代成熟植株11個經濟性狀的比較中，7個性狀差異顯著［19］。在對5個主要產量性狀進行的遺傳分析中，證明不同農家類型的產量和產量構成因素有較高的遺傳力，單根重、根粗、莖粗與單產呈極顯著正相關，各產量因素與產量構成因素有較大的選擇改良潛力［20］。對7個不同類型的100個性狀進行了性狀相關分析，對60個性狀進行主成分分析，累積貢獻率大於85%的3個主成分是齊墩果酸、生長勢和總皂苷［21］。這些遺傳參數既為選種工作中性狀選擇提供了依據，又為性狀連鎖分析提供了線索。 2.3 種子的發育生理和貯存方法人參種子屬胚構造發育不完全類型，須經後熟才能發芽出苗［22］。後熟過程分胚形態後熟和生理後熟2個時期。需溫規律是：形態後熟需18～12℃變溫3～4個月，生理後熟需2～4℃低溫2～3個月。在生理後熟期發生的生理生化變化及利用生長調節劑促進後熟打破休眠的研究也取得進展［23］。為解決人參種子中、長期保存問題，人參種子的低溫、超低溫保存技術已被研究，石思信等［24］將人參種子放在-196℃的低溫下保存近1年後，發現種子生活力為90%，經後熟處理，裂口率和田間出苗率和對照無明顯差異，形態發育和苗期生長正常，說明人參種子能忍耐乾燥和低溫，屬正常種子範疇。3 人參種質資源研究的新方法近年來分子生物技術在人參真偽鑑別［25～26］、系統學考察研究等方面已有報導，但在種質資源領域還少見報導。種質資源的傳統研究方法(子代分析法)耗時長、困難大，嚴重製約了種質資源的研究。 DNA指紋等新技術的出現改變了傳統的研究模式，通過直接比較不同種質DNA的差異性並藉助計算機程序來分析種質遺傳關係，大大加快了種質資源的研究，使本需幾年才能完成的工作縮短到幾週甚至幾天。我們利用DNA分子標記技術率先對國產人參種質資源進行了系統研究，此前還建立和改進了有關實驗方法。 3.1 提取人參微量DNA的新方法馬小軍等［27］設計的提取人參微量DNA的新方法，DNA得率比通常所用CTAB法高5000倍，也超過多種提取方法。用比色法和電泳法檢測DNA得率約為2250μg.g-1。該法僅保留了CTAB法十幾個步驟中的兩個關鍵步驟，略去其它步驟，不僅得率高，而且得到的DNA較完整，擴增效果較好。應用毛細管PCR方法擴增RAPD(隨機擴增的多態性DNA分析)指紋，僅用0.001g的材料即可進行2000多次PCR反應，這說明該法是提取珍稀藥材微量DNA的有效方法。 3.2 快速擴增人參微量DNA的毛細管PCR方法RAPD是藥材DNA指紋鑑定技術中最簡便的一種，該方法一般在Eendorf離心管進行PCR反應，擴增DNA指紋，但費用高(反應體積大)、耗時長，需DNA模板量較多。因此其應用受到一定限制。近年發展起來的毛細管PCR方法在一定程度上彌補了這一缺點，後者優點是：①反應體系小，省試劑和材料。 ②毛細玻璃管管壁比普通薄壁管感溫靈敏、傳熱快，反應介質與反應環境接觸面積相對大，提高了Taq酶功效，反應時間縮短三分之二。馬小軍等［28］將其用於人參種質分析，系統比較了不同條件擴增人參RAPD指紋的效果，建立並優化了擴增人參RAPD指紋的反應體系。 3.3 分析DNA指紋的PCR-RFLP方法經典RFLP方法需經酶切、電泳、Southern轉移、與探針雜交、放射自顯影等繁瑣的步驟，DNA需要量大(μg級)，因而難以在藥用植物研究中廣泛應用。為了獲得更多的人參DNA遺傳信息，鑑定隨機擴增產物的同源性以及更有效地利用DNA分子標記研究人參種質資源，馬小軍等［29］對毛細管CR擴增產物進行限制性內切酶消化和酶切位點分析，結果表明PCR-RFLP是篩選藥材特異DNA分子標記的一種簡易方法，尤其對那些因擴增條帶太少在RAPD分析中本欲摒棄的引物加以再利用，有效的提高了DNA指紋的使用效率，因而也是藥用植物種質資源研究的另一工具。 3.4 栽培群體遺傳分化指數DC值和PDC值的分析方法遺傳分化指數(DC)和分化指數比(PDC)是汪小全等為統計RAPD檢測結果而提出的一個新方法，主要用於分析野生植物的遺傳結構。馬小軍等［30］首次將其引入栽培作物種質資源研究，並對已知親緣關係的幾個人參栽培群體加以分析。結果得到了與事實完全相符的結論，驗證了這種統計方法的可靠性。由此認為該方法作為一種較敏感的分析手段適用於作物種質資源的比較、鑑定；不同育種材料親緣關係的判斷以及群體純度檢測等方面。
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